DNA izolasyonu, organik açıdan bozulmamış olan hücrelerde özel teknikler aracılığıyla DNA molekülünün ortaya çıkarılmasına verilen isimdir. DNA, hücre içerisinde; kloroplastlarda, mitokondride ve çekirdekte yer almaktadır. DNA izolasyonu ise oldukça farklı amaçlar için kullanılabilmektedir.
DNA İzolasyonun En Çok Tercih Edildiği Alanlar
- Adli tıp
- Parmak izi
- Taksonomi
- Hastalıkların teşhis edilmesi
- Evrimsel bağlantıların araştırılması
- Moleküler genetik çalışmalarında
- Gen klonlamasında şeklindedir.
Ek olarak DNA molekülü; suda çözünebilir ancak alkolde çözünmez ve negatif yüklüdür.
DNA İzolasyonu Yöntemlerinde Kullanılan Aşamalar
- Hücrenin parçalanması ile molekül ağırlıklı DNA'nın ortaya çıkması.
- Proteoliz ve denatürasyon yöntemleri ile DNA-protein kompleksinin ayrıştırılması ve DNA'nın çözünür hale getirilmesi.
- Basit enzimatik ya da kimyasal yöntemlerle DNA'nın protein, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrıştırılması.
DNA izolasnyou için kullanılan yöntemlerden biri olan denatürasyon; DNA molekülünün yapısında çözünme sağlamak için molekülün yüksek pH ya da yüksek sıcaklık değerinde bırakılması işlemidir. Renatürasyon ise; DNA molekülünün sarmal yapısının eski haline dönebilmesi için koşulların tekrar normalleştirilmesi sürecidir. Renatürasyon için denatürasyonun geri dönüşümü denebilir.
DNA izolasyonunun en önemli aşaması olan hücre duvarının parçalanması fiziksel parçalama ve kimyasal madde ile işlem kısımlarından oluşmaktadır. Fiziksel parçalama dondurup - çözme eylemlerinden oluşurken kimyasal kısım pek çok farklı madde içerir. Bu maddeler:
- Tuz: Hücre duvarından geçerek DNA'ı proteinlerden ayırır.
- Deterjan: Hücre duvarının geçirgenliğini çoğaltarak hücre içeriğinin serbest bırakılmasını sağlar.
- Etil asetat, toluen, SDS: Membran yapısını bozmaya yardımcı olur.
- İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin çöktürülmesini kolaylaştırır.
- Amonyum sülfat ve sodyum sülfat: Proteinleri çöktürür.
- Proteinaz: Homojen bir karışım elde edilmesini destekler.
- Rnaz: Hücre içinde bulunan RNA'lar, tek iplik şeklinde stabil olabildiklerinden onların da ortamdan uzaklaştırılması gerekir ve bunun için Rnaz işlemi uygulanır.
Hücre membranın parçalanması DNA'nın nükleazlardan uzaklaştırılmasını ve DNA-protein kompleksinin çözülmesini de beraberinde getirir
DNA ekstraksiyonu için SDS ve CTAB gibi çözücüler ile işlem yapılır ve böylece hücre zarı parçalanır. Saflaştırmaya çalışılan DNA, organik bir molekül olduğundan nükleazlar tarafından enzimatik olarak parçalanabilmektedir. Bu nedenle nükleazlardan ayrıştırılması gerekir. DNA'nın protein kompleksinden uzaklaştırılması için de kloroform ve fenol karışımı eklenir. Böylece DNA'nın saflaştırılma işlemi gerçekleşmeye başlamış olur.
